Institut Kirchhoff Berlin GmbH

Folsäure

Stand: 08.2017

Bestimmung von Folaten mittels LC-MS/MS

Hintergrund

In den Anlagen der Verordnung über diätische Lebensmittel (Diätverordnung) sind die Mindest- und Höchstmengen an Folsäure für Säuglingsanfangsnahrung bzw. Folgenahrung pro 100 kJ bzw. pro 100 kcal festgelegt. In der delegierten Verordnung (EU) 2016/127 vom 25. September 2015, als Ergänzung zur Verordnung (EU) Nr. 609/2013 über Lebensmittel für Säuglinge und Kleinkinder (SpezialLMVO), ist nicht mehr nur Folsäure aufgeführt, sondern Mindest- und Höchstmengen für Folat berechnet als Diätisches Folat-Äquivalent (DFE) festgelegt.

1μg DFE = 1 μg Nahrungsfolat = 0,6 μg synthetische Folsäure bzw.

μg DFE /100kJ = μg Nahrungsfolat /100kJ + 1,67 x μg synthetische Folsäure/100kJ

Die Verordnung ist am 22. Februar 2016 in Kraft getreten und gilt ab dem 22. Februar 2020, außer für Säuglingsanfangs- und Folgenahrung die aus Proteinhydrolisaten hergestellt werden, für die sie ab dem 22. Februar 2021 gilt. Die Definition des Diätetischen Folat-Äquivalents macht es zwingend erforderlich, die Folate nicht als Gesamt-Folat zu quantifizieren, sondern aufgrund unterschiedlicher Bioverfügbarkeit zwischen den Folsäure-Derivaten zu differenzieren.

Analytik

Die im IKB etablierten Verfahren zur Folatbestimmung boten bisher zwei Möglichkeiten der Analytik. Zum einen die Bestimmung des Gesamt-Folatgehaltes der endogenen und supplementierten Folate durch das mikrobiologische Verfahren gemäß DIN EN 14131 : 2003 (mod.). Zum anderen die Bestimmung von supplementierter Folsäure in höheren Konzentrationen (z. B. in Vitaminmixen) über das Inhouse-Verfahren (IKB 00.12.34.LC) mittels HPLC-UV.
Aufgrund der neuen rechtlichen Definition des Diätischen Folat-Äquivalents ergibt sich damit ein Defizit bei den etablierten Verfahren in Bezug auf die Anforderung einer differenzierten Quantifizierung. Beim mikrobiologischen Normverfahren kann nicht zwischen einzelnen Folaten unterschieden werden. Außerdem erfolgt die Metabolisierung der einzelnen Vitamere durch den Keim nicht gleichwertig. Das HPLC-UV-Verfahren ist für die Bestimmung in milchpulverbasierter Säuglingsnahrung zu unempfindlich und nicht spezifisch genug.

Folatbestimmung mittels LC-MS/MS

Die Bestimmung von Folaten mittels LC-MS/MS ermöglicht die differenzierte Erfassung von supplementierter Folsäure und endogenen Folaten. Dabei ist es möglich,  die relevanten Folsäure-Derivate zu identifizieren und aufgrund der Verfügbarkeit isotopenmarkierter Standards zu quantifizieren.
Die Probenvorbereitung ist in zwei wesentliche Schritte unterteilt. Zunächst erfolgt eine enzymatische Spaltung der als Di,- Tri- und Polyglutamat vorliegenden Folate in die Monoglutamatverbindung. Im zweiten Schritt wird der erhaltene Probenextrakt durch Festphasenextraktion (SPE) aufgereinigt. Anschließend erfolgt nach HPLC-Trennung die Bestimmung mittels massenspektrometrischer Detektion. Durch die hohe Selektivität der Detektion mittels MS/MS ist die differenzierte Bestimmung verschiedener Folate auch in komplexen Matrices und in geringen Konzentrationsbereichen möglich.
Die Validierung der erstellten  Methode belegt Richtigkeit und Präzision des Verfahrens für Säuglingsnahrung auf Milchpulverbasis (Überprüfung mit dem zertifizierten Referenzmaterial NIST 1849a). Die erweiterte Messunsicherheit liegt bei 25%. Abhängig vom Vitamer liegt die Bestimmungsgrenze zwischen 0,1 bis 1 μg/100g.

Um den rechtlichen Anforderungen der Verordnung (EU) 2016/127 als Ergänzung der Verordnung (EU) Nr. 609/2013 hinsichtlich des Gesamt-Folatgehaltes gerecht zu werden, ist es von analytischer Seite aus zwingend notwendig, den Herstellern von Säuglingsanfangs- und Folgenahrung eine Methode zur Differenzierung der verschiedenen Folsäure-Derivate zur Verfügung zu stellen. Bislang etablierte Methoden quantifizieren den Gesamt-Folatgehalt ohne Differenzierung der einzelnen Folate. Mit der im Institut Kirchhoff erstellten LC-MS/MS Methode ist es nun möglich, zwischen den endogenen und supplementierten Hauptfolaten zu unterscheiden.

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